MÁY XÉT NGHIỆM CÔNG THỨC MÁU TỰ ĐỘNG
Tác giả: Bs Trương Bích Liễu
Nội dung: Lịch sử phát triển, nguyên lý đo, các sai sót do phương pháp đo của từng máy, kết quả bị ảnh hưởng do mẫu máu và cách khắc phục…..
Xét nghiệm Công thức máu (Complete Blood Count = CBC) hay còn gọi là Huyết đồ là một trong những xét nghiệm định lượng xuất hiện đầu tiên trong số các xét nghiệm định lượng và hiện nay xét nghiệm công thức máu được sử dụng khá phổ biến trong lâm sàng.
Ban đầu người ta đếm bằng cách cho mẫu máu cần xét nghiệm vào một buồng đếm rồi quan sát dưới kính hiển vi quang học. Các kỹ thuật sau này có liên quan đến phương pháp dòng chảy đếm số lượng tế bào máu một cách tự động dựa trên phương pháp điện trở kháng hoặc tán xạ ánh sáng/ kỹ thuật huỳnh quang khi cho từng tế bào một đi qua khe đếm.
Xét nghiệm công thức máu lần đầu tiên được thực hiện bởi ông Karl Vierordt – một nhà sinh lý học người Đức tại Đại học Tu¨ bingen, nghiên cứu được công bố vào năm 1852. Ông lấy máu bệnh nhân cho vào ống mao quản sau đó ông trải một thể tích máu đã biết trên một lame kính và đếm dưới kính hiển vi quang học.
Những năm sau đó phương pháp này được cải tiến lên bằng một số phương pháp như sử dụng ống mao quản hình e-lip hoặc khắc mạng lưới các ô vuông lên buồng đếm để đếm các tế bào dễ dàng hơn. Những cải tiến này làm cho việc đếm số lượng chính xác hơn nhưng chậm, mất nhiều thời gian.
Các máy xét nghiệm công thức máu tự động hiện nay chủ yếu dựa trên 2 phương pháp điện và phương pháp đo quang:
1. Phương pháp đo quang:
1.1 Lịch sử:
Vào cuối những năm 1940, ông Wallace Coulter đã nghiên cứu một phương pháp đánh giá các hạt trong nước sơn. Những trải nghiệm trong hải quân và việc chứng kiến hậu quả sau vụ nổ bom nguyên tử vào cuối chiến tranh thế giới thứ 2 đã thúc đẩy ông tìm kiếm cách thức để ứng dụng kỹ thuật của mình vào việc đếm tế bào máu. Trong một phát minh được gọi là hiệu ứng Coulter, ông đã chế tạo được một dụng cụ phân tích tế bào máu đơn giản có thể đếm số lượng tế bào máu một cách nhanh chóng. Hiệu ứng Coulter dựa trên nguyên lý các tế bào máu là chất dẫn điện kém so với với dung dịch muối và khi cho các tế bào máu riêng lẻ đi qua một lỗ nhỏ cùng lúc với dòng điện làm giảm cường độ dòng điện, khi càng nhiều tế bào đi qua thì điện trở xuất hiện càng lớn do các hạt có tính chất cản trở điện. Độ lớn của xung điện tỉ lệ với thể tích của tế bào, số lượng xung điện tương ứng với số lượng tế bào. Đây chính là nền tảng để đếm và phân loại tế bào dựa trên kích thước. Khái niệm đơn giản này đã làm nền tảng cho sự phát triển của các thế hệ máy phân tích huyêt học tự động hiện đại sau này.
Sau phát minh của ông Coulter vào năm 1953, sau này có nhiều sự cải tiến hơn, phổ biến là đếm tế bào dòng chảy bằng cách cho tế bào chảy trực tiếp qua kênh đếm (flow cell) hoặc buồng đếm (chamber) thay vì đi qua một khe hở (aperture) như trước.
Năm 1965, ông Fulwyler sử dụng phương pháp đếm của ông Coulter để đo thể tích tế bào. Phương pháp của ông Fulwyler và phương pháp dựa trên huỳnh quang của ông Julius và cộng sự là nền tảng quan trọng cho kỹ thuật phân loại tế bào tự động sau này.
1.2 Nguyên lý:
Nguyên lý tập trung thủy động lực học (Hydrodynamic focusing)
+Hỗn dịch pha loãng tế bào được chuyển từ buồng trộn tới buồng đếm
+Hỗn dịch được bơm vào dòng dung dịch Sheath đang chảy nhanh
+Hai dòng dịch này chảy với tốc độ khác nhau và không bị lẫn vào nhau
+Cấu trúc đặc biệt của buồng đếm + Tốc độ chảy cao của dòng dung dịch Sheath ép dòng tế bào dịch chuyển theo thứ tự từng tế bào
• Ánh sáng tán xạ gồm ánh sáng tán xạ thẳng- forward scatter (FSC) và ánh sáng tán xạ bên – side scatter (SSC).
• FSC bao gồm các ánh sáng bị nhiễu xạ,dùng để phân biệt về kích thước hoặc thể tích tế bào
SSC bao gồm hầu hết các ánh sáng khúc xạ và ánh xạ, được thu ở góc 90o so với chùm tia tới laser, tỉ lệ với thành phần các hạt hoặc độ phức tạp bên trong tế bào
Ghi nhận tín hiệu ánh sáng tán xạ:
• Ánh sáng được tán xạ qua 4 góc: 0 độ, 10 độ, 90 độ và 90 độ D
• Các tín hiệu ánh sáng tán xạ được tạo ra bởi các hạt đi qua chùm tia lazer trong một dòng dung dịch được chuyển thành tín hiệu điện và được ghi nhận nhờ photodetector: photodiode (PDs) và photomultiplier tubes (PMTs). Photocathode của PMT có độ nhạy cao hơn so với PD. PD có khả năng chuyển ánh sáng thành photoelectron hiệu quả hơn. PD có khả năng phát hiện các tín hiệu ánh sáng mạnh hơn được tạo ra bởi FSC. PMTs thường được sử dụng để phát hiện các tín hiệu yếu hơn được tạo ra bởi SSC và ánh sáng huỳnh quang.
• Phân tích tế bào máu bằng máy đếm laser sẽ phân biệt được 5 loại bạch cầu: Neutrophil, Lymphocyte, Monocyte, Eosinophil và Basophil
2. Phương pháp dựa trên phép đo điện:
2.1 Lịch sử
Vào cuối những năm 1940, ông Wallace Coulter đã nghiên cứu một phương pháp đánh giá các hạt trong nước sơn. Những trải nghiệm trong hải quân và việc chứng kiến hậu quả sau vụ nổ bom nguyên tử vào cuối chiến tranh thế giới thứ 2 đã thúc đẩy ông tìm kiếm cách thức để ứng dụng kỹ thuật của mình vào việc đếm tế bào máu. Trong một phát minh được gọi là hiệu ứng Coulter, ông đã chế tạo được một dụng cụ phân tích tế bào máu đơn giản có thể đếm số lượng tế bào máu một cách nhanh chóng. Hiệu ứng Coulter dựa trên nguyên lý các tế bào máu là chất dẫn điện kém so với với dung dịch muối và khi cho các tế bào máu riêng lẻ đi qua một lỗ nhỏ cùng lúc với dòng điện làm giảm cường độ dòng điện, khi càng nhiều tế bào đi qua thì điện trở xuất hiện càng lớn do các hạt có tính chất cản trở điện. Độ lớn của xung điện tỉ lệ với thể tích của tế bào, số lượng xung điện tương ứng với số lượng tế bào. Đây chính là nền tảng để đếm và phân loại tế bào dựa trên kích thước. Khái niệm đơn giản này đã làm nền tảng cho sự phát triển của các thế hệ máy phân tích huyêt học tự động hiện đại sau này.
Sau phát minh của ông Coulter vào năm 1953 thì có nhiều sự cải tiến hơn sau này, phổ biến là đếm tế bào dòng chảy bằng cách cho tế bào chảy trực tiếp qua kênh đếm (flow cell) hoặc buồng đếm (chamber) thay vì đi qua một khe hở (aperture) như trước.
Năm 1965, ông Fulwyler sử dụng phương pháp đếm của ông Coulter để đo thể tích tế bào. Phương pháp của ông Fulwyler và phương pháp dựa trên huỳnh quang của ông Julius và cộng sự là nền tảng quan trọng cho kỹ thuật phân loại tế bào tự động sau này.
2.2 Nguyên lý:
Buồng đếm gồm 2 ngăn thông nhau qua một lỗ nhỏ nằm trên phiến Aperture. Ở mỗi ngăn có gắn điện cực, hai điện cực của hai ngăn trái dấu nhau. Giữa hai điện cực có một điện thế ổn định. Dung môi dẫn điện là hóa chất chạy máy
Tế bào di chuyển từ ngăn trái sang ngăn phải. Tế bào không dẫn điện nên chính nó tạo ra một điện trở. Do đó khi đi qua lỗ đếm, tế bào làm thay đổi điện thế vốn ổn định giữa hai điện cực. Sự thay đổi đột ngột điện thế giữa hai điện cực được máy biểu hiện dưới dạng xung điện. Tế bào có kích thước lớn tạo ra xung điện có biên độ lớn và ngược lại, tế bào có kích thước nhỏ tạo ra xung điện có biên độ nhỏ. Tổng số xung điện thu được là tổng số tế bào đi qua lỗ đếm. Biên độ xung điện còn được dùng để phân loại tế bào.
Phương pháp đo trở kháng sẽ cho kết quả có 3 loại bạch cầu: Granular (Neutrophil), Mid bao gồm những bạch cầu có kích thước trung bình (Monocyte, Eosinophil, Basophil ) và bạch cầu Lymphocyte
Trong máu ngoại biên bạch cầu Mono có kích thước lớn nhất trog 5 loại bạch cầu. Nhưng khi chạy máy, hóa chất sẽ làm vỡ tế bào chất của bạch cầu, chỉ có nhân tế bào bạch cầu đi vào buồng đếm, do đó kích thước bạch cầu Neutrophil > Mid (Monocyte, Eosinophil, Basophil ) > Lymphocyte
Trục đứng biểu thị số lượng, trục ngang biểu thị kích thước
3. Những hạn chế trong quá trình phân tích tế bào máu bằng máy đếm tự động:
Ở mỗi máy xét nghiệm công thức máu sẽ có những hạn chế riêng tùy vào phương pháp đo. Một trong những lỗi sai phổ biến của máy là mảnh vỡ hồng cầu, bạch cầu, hồng nhỏ bị đếm nhầm thành tiểu cầu làm tăng giả tạo số lượng tiểu cầu; hay trong một số trường hợp tiểu cầu kết cụm bị đếm nhầm thành bạch cầu dẫn đến số lượng tiểu cầu bị giảm mà bạch cầu lại tăng. Trong một số trường hợp hồng cầu bệnh nhân chứa HbS, HbC thì sẽ khó bị ly giải và những hồng cầu không bị ly giải máy sẽ đếm thành hồng cầu nhân hoặc bạch cầu, trong trường hợp này nồng độ Hgb sẽ thấp và số lượng hồng cầu nhân, bạch cầu sẽ tăng cao hơn.
4. Những hạn chế do mẫu máu: Kháng thể lạnh, mỡ máu cao, bilirubin cao, máu bị tán huyết, tiểu cầu kết cụm, hồng cầu nhân…
Tài liệu tham khảo:
1.https://www.researchgate.net/…/272186770_Development_Histor…
2. Bernadette F. Rodak (2012). Hematology Clinical Principles and Application, Fourth Edition
