[Vi sinh lâm sàng số 1] PHÂN LOẠI VI KHUẨN

Tên của tất cả sinh vật được chia gồm 2 phần: chi rồi đến loài (vd: Homo sapiens). Vi khuẩn cũng được đưa về một nhóm chung và được đặt tên dựa trên sự khác nhau về hình thái học và chuyển hóa hóa sinh. Tuy nhiên, hiện nay vi khuẩn cũng được phân loại dựa trên sự miễn dịch và đặc tính di truyền. Trong chương này, sẽ tập trung chủ yếu vào tính bắt màu Gram, hình thái và đặc trưng chuyển hóa của vi khuẩn, tất cả những điều đó cho phép người thầy thuốc lâm sàng nhanh chóng xác định sự nhiễm trùng trên bệnh nhân.

Sự Biến Đổi Màu Của Nhuộm Gram

Vì vi khuẩn không có màu sắc và thường không thể thấy dưới đèn quang học của kính hiển vi. Việc nhuộm nhiều màu sắc lên vi khuẩn đã giúp cho việc hình dung ra hình thể của chúng và được sử dụng nhiều nhất là phương pháp nhuộn Gram, điều này đã phân vi khuẩn ra làm 2 nhóm chính: nhóm Gram dương (Gram-Positive) và nhóm Gram âm (Gram-Negative). Phương pháp nhuộm này có thể cho phép thầy sàng thuốc lâm xác định có phải vi khuẩn là hình tròn hay hình que không.Với bất kỳ phương pháp nhuộm nào, đầu tiên ta phải phết lên trên mặt bản kính mẫu vật cần nhuộm (nước bọt, dịch mủ…) và sau đó hơ nóng nhẹ bằng ngọn lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn lên mặt kính. Có 4 bước để nhuộm Gram:

1) Đổ thuốc nhuộm tím tinh thể (tím gentian) hoặc thuốc nhuộm xanh và chờ trong 60 giây
2) Rửa sạch với nước (tối đa 5 giây) và rồi ngâm với dung dịch iod
3) Rửa sạch với nước và sau đó khử màu bằng dung dịch cồn 95%
4) Cuối cùng, khử chất nhuộm với safranin (thuốc nhuộm đỏ). Chờ trong 30 giây và sau đó rửa sạch lại với nước
Khi xem mẫu vật cẩn thận dưới kính hiển vi, ta sẽ thấy thuốc nhuộm đã được hấp thụ và được giữ lại bên trong tế bào và làm nó chuyển thành màu xanh, đó là vi khuẩn Gram dương. Nếu thuốc nhuộm bị rửa sạch bởi cồn, thì tế bào sẽ hấp thu thuốc nhuộm safranin và chuyển thành màu đỏ, thì đó là vi khuẩn Gram âm.
Gram(+) = Xanh !!!
Gram(-) = Đỏ !!!
Sự khác nhau của những phương pháp nhuộm Gram là kết quả do sự cấu tạo khác nhau về vách tế bào của khuẩn Gram dương và khuẩn Gram âm. Cả hai khuẩn Gram dương và khuẩn Gram âm đều có nhiều hơn một lớp tế bào bảo vệ tế bào chất và nhân từ các tác nhân của môi trường ngoại bào. Không giống như tế bào của động vật là chúng chỉ có một lớp màng nguyên sinh thuộc lớp phospholipid kép. Lớp màng bao bên ngoài ngoài tế bào chất của vi khuẩn được gọi là lớp peptidoglycan hay là vách tế bào sẽ được trình bày rõ trong cả hai khuẩn Gram dương và khuẩn Gram âm

 

1.1. Lớp peptidoglycan

hay lớp vách tế bào được cấu tạo gồm sự lặp lại và kéo dài của một disaccharid liên kết với 4 amino acid

1.2. Chuỗi amino acid của lớp peptidoglycan liên kết với chuỗi amino acid kế bên bằng liên kết đồng hóa trị. Đó là kết quả do cấu trúc ổn định của sự lưu hóa (cross-linked). Enzym tham gia xúc tác cho sự hình thành các liên kết được gọi là enzym transpeptidase và nó nằm trong màng nguyên sinh. Kháng sinh penicillin sẽ gắn kết và ức chế hoạt động của các enzym này. Đó là lý do giải thích tại sao các enzym đó còn được gọi là penicillin biding protein (xem trang )

1.3. Các khuẩn Gram dương có vách tế bào rất dày và có rất nhiều các liên kết ngang (crosslinking) trong chuỗi của các amino acid. Ngược lại, các khuẩn Gram âm có vách tế bào rất mỏng và có mô hình liên kết ngang khá đơn giản.

1.4. Vỏ bao bên ngoài vách tế bào của vi khuẩn Gram dương có cấu tạo rất phức tạp như là các liên kết peptidoglycan, acid teichoic, poly saccharid và các protein khác. Bề mặt bên trong vách tế bào tiếp xúc với màng nguyên sinh. Màng nguyên sinh có chứa các protein, đó là những cầu nối (span) của lớp kép lipid. Màng nguyên sinh của vi khuẩn không có cấu trúc cholesterol hay các sterol khác (không giống như của động vật). Một sự hiện diện rất quan trọng trong cấu trúc thành vế bào của khuẩn Gram dương là acid teichoic. Nó quyết định vai trò hoạt động như là một kháng nguyên, cho nên nó rất quan trọng trong việc xác định huyết thanh của rất nhiều loài Gram dương.

1.5. Vỏ của vi khuẩn Gram âm gồm có 3 lớp, không tính tới khoảng chu chất (periplasmic space). Tương tự như vi khuẩn Gram dương, vi khuẩn Gram âm có (1) Một màng nguyên sinh được bao quanh bởi (2) Một lớp peptidoglycan. (3) Ngoài ra, một tế bào vi khuẩn Gram âm còn có một màng nguyên sinh bên ngoài duy nhất. Bên trong màng nguyên sinh (tương tự bên trong vi khuẩn Gram dương) có protein gắn vào lớp phospholipid kép. Vi khuẩn Gram âm có khoảng chu chất nằm ở giữa màng nguyên sinh và lớp peptidoglycan mỏng vô cực. Bên trong chu chất là một chất gel gồm có các protein và enzym. Lớp peptidoglycan mỏng không có chứa acid teichoic, mặc dù vẫn có các lipoprotein xoắn được gọi là murein lipoprotein. Các lipoprotein này rất quan trọng, vì nó bắt nguồn từ lớp peptidoglycan và di chuyển ra bên ngoài để gắn kết đặc hiệu với các chất ở bên ngoài màng. Lớp màng ngoài cùng này cũng tương tự như những màng vào bên trong. Và điều làm cho lớp vỏ của khuẩn Gram âm có phần độc đáo đó là phần ngoài cùng của lớp kép chứa lipopolysaccharide (LPS).

1.6. Lipopolysaccharide được cấu tạo bởi 3 thành phần liên kết đồng hóa trị:
(1). Chuỗi carbohydrat ở vị trí 1 – 50 của oligosaccharid kéo dài ra môi trường bên ngoài (outer). Chính điều đó làm nên sự khác biệt so với các loài sinh vật khác và là yếu tố quyết định kháng nguyên (antigenic), nên phần đó được gọi là Kháng nguyên thân O (O-specific side chain) hay Kháng nguyên O (Nhớ O trong Outer!).
(2). Phần trung tâm Kháng nguyên O là lõi polysaccharide (core polysaccharide) tan được trong nước
(3). Thành phần thứ ba bên trong lõi polysaccharide là lipid A, đó là một disaccharide với nhiều đuôi acid béo kép duỗi dài ra tới màng. Lipid A là một chất độc đối với con người, và nó được biết như là một chất độc tố nội sinh (Endotoxin) của vi khuẩn Gram âm. Khi hoạt động miễn dịch của cơ thể làm vỡ màng của vi khuẩn Gram âm thì những mảnh vỡ có chứa lipid A sẽ được giải phóng vào hệ tuần hoàn và gây nên những cơn sốt, tiêu chảy hay cũng có thể gây tử vong do nhiễm trùng huyết (hay còn gọi là sốc nhiễm khuẩn – septic shock).
Gắn vào màng của vi khuẩn Gram âm là các protein lỗ xuyên màng (porin protein), chúng cho phép các chất dinh dưỡng đi qua màng tế bào

VẬY NÓ CÓ Ý NGHĨA GÌ TRÊN LÂM SÀNG ?

Sự khác nhau giữa khuẩn Gram dương và khuẩn Gram âm dẫn đến sự tác động khác nhau với môi trường. Lớp peptidoglycan dày của vi khuẩn Gram dương cho phép các chất có trọng lượng phân tử thấp khuếch tán qua, cho nên những chất gây hư hại cho màng nguyên sinh (như kháng sinh, thuốc nhuộm, chất tẩy rửa…) có thể đi vào. Tuy nhiên, đối với vi khuẩn Gram âm bên ngoài màng tế bào có chứa lipopolysaccharide ngăn chặn các hợp chất gây hư hại đó đi tới lớp peptidoglycan và lớp màng nguyên sinh dễ bị tổn thương ở bên trong…Vì thế, các chất kháng sinh hay hóa chất dùng để tấn công vách peptidoglycan (như là penicillins, lysozyme…) không thể đi vào. Điều thú vị ở đây là các tím tinh thể dùng để nhuộm Gram là loại phức hợp thuốc nhuộm lớn sẽ bị các liên kết ngang (cross-linked) ở màng dày của vách vi khuẩn Gram dương giữ lại, kết quả là làm Gram dương có màu xanh.

Lớp màng tế bào có chứa chất lipid ở bên ngoài của vi khuẩn Gram âm bị ly giải một phần do cồn, do đó khi rửa sạch tím tinh thể và nhuộm bằng chất phản nhuộm (counterstain) safranin thì Gram âm sẽ có màu đỏ.

1.7. Tóm lượt sự khác nhau giữa vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm

PHÂN LOẠI VI KHUẨN

Vi khuẩn có 4 hình dạng chính:
(1) Cầu khuẩn (cocci): có dạng hình cầu
(2) Trực khuẩn (bacilli): có dạng hình que. Trực khuẩn ngắn thì được gọi là coccobacilli
(3) Xoắn khuẩn (Spiral forms): có dạng hình dấu phẩy, hình chữ S, hình xoắn (spiral shaped)
(4) Khuẩn đa hình thể (Pleomorphic): không có một hình dạng cụ thể (giống như thạch rau câu)
Ngoài các vi khuẩn có hình dạng điển hình trên còn có các vi khuẩn có hình dạng trung gian, ví dụ như là một cặp (song cầu khuẩn – diplococci), một cụm, một dải hay vi khuẩn lông roi.

1.8. Phân loại vi khuẩn

VẬY TÊN CỦA CHÚNG LÀ GÌ ?GRAM DƯƠNG

Hãy bắt đầu ghi nhớ 7 loại vi khuẩn Gram dương kinh điển là nguyên nhân gây nên các căn bệnh cho con người và về cơ bản thì những vi khuẩn khác là những vi khuẩn Gram âm.
Trong vi khuẩn Gram dương gồm có: 3 vi khuẩn hình cầu và 4 vi khuẩn hình que (bacilli)
Có 3 vi khuẩn Gram dương hình cầu đều có từ coccus trong tên của chúng:
1) Streptococcus (Liên cầu khuẩn) và 2) Enterococcus có dạng dải của tụ cầu
3) Staphylococcus (Tụ cầu khuẩn) có dạng chùm của tụ cầu
2 trong 4 loài vi khuẩn hình que Gram dương có tạo nha bào (spores) (dạng hình cầu, đó là khi vi khuẩn trở về dạng không hoạt động khi ở môi trường không thuận lợi). Đó là:
4) Bacillus
5) Clostridium
2 vi khuẩn Gram dương cuối không có dạng hình que:
6) Corynebacterium
7) Listeria

GRAM ÂM

Trong nhóm vi khuẩn Gram âm, chỉ có 2 nhóm vi khuẩn Gram âm hình cầu, đó là song cầu khuẩn (giống như 2 hạt café đang hôn nhau): Neisseria và Moraxella
Cũng chỉ có duy nhất 1 nhóm vi khuẩn hình xoắn: Xoắn khuẩn (Xoắn khuẩn). Trong nhóm đó đã bao gồm vi khuẩn Treponema pallidum (gây bệnh giang mai)
Phần còn lại là loại vi khuẩn Gram âm hình que hoặc đa hình thể

NGOẠI LỆ

1) Mycobacteria là một loại Gram dương khá yếu ớt nhưng được nhuộm với một phương pháp đặc biệt được gọi là nhuộm kháng acid (acid-fast stain) hay còn được đến là phương pháp nhuộm soi trực tiếp Zielh – Neelsen. Nhóm đặc biệt này bao gồm các vi khuẩn gây nên bệnh lao (tuberculosis) và bệnh phong (leprosy)

2) Xoắn khuẩn (Spirochetes) cũng có 1 vách tế bào thuộc Gram âm nhưng nó rất nhỏ so với đèn quang học kính hiển vi và phải được xem dưới kính hiển vi trong trường tối đặc biệt. Xoắn khuẩn rất mảnh khảnh và cuộn chặt lại. Từ trong ra ngoài, nó có chất nguyên sinh được bao quanh bởi màng nguyên sinh. Cũng giống như các vi khuẩn Gram âm khác, nó cũng có 1 lớp peptidoglycan mỏng (vách tế bào) được bao quanh bởi màng lipoprotein có chứa LPS ở bên ngoài. Tuy nhiên, xoắn khuẩn còn được bao quanh thêm bởi một màng giàu phospholipid và một vài protein tiếp xúc, đây là những thứ được cho là có tác dụng bảo vệ xoắn khuẩn, giúp tránh miễn dịch nhận nhận dạng được (vi sinh vật “lén lút”). Lông mọc qua thành tế bào ở vị trí đầu của xoắn khuẩn, nhưng thay vì nhô ra khỏi màng bên ngoài (giống như các vi khuẩn khác được trình bày ở 2.1) thì lông lại mọc hướng về một bên dọc theo bên dưới màng của xoắn khuẩn. Trong chuyên môn gọi đó là lông chu chất (periplasmic flagella). Sự xoay vòng của lông chu chất làm cho xoắn khuẩn xoay xung quanh theo vòng tròn và tạo ra lực đẩy chúng về phía trước

3) Mycoplasma không có vách tế bào. Chúng chỉ có một màng tế bào đơn giản, vì vậy nó không thuộc Gram dương và cả Gram âm

1.9. Tóm Tắt Sự Khác Nhau Về Hình Thái Giữa Các Vi Khuẩn

CẤU TRÚC CỦA TẾ BÀO CHẤT

ADN của vi khuẩn thường gồm có sợi kép ADN tạo thành 1 hình vòng tròn. Vòng tròn nhỏ liền kề sợi kép ADN được gọi là plasmid, chúng thường chứa các gen có khảng năng chống lại kháng sinh. Ribosom được hình thành từ phức hệ protein và ARN và có liên quan tới quá trình dịch mã, hay còn là quá trình tổng hợp protein. Vi khuẩn thuộc loại không có màng nhân (procaryote), có ribosom (70S) nhỏ hơn ribosom của động vật (80S) là loại ribosom có màng nhân (eucaryote). Ribosom của vi khuẩn gồm có 2 tiểu đơn vị (subunit): 1 tiểu đơn vị lớn (50S) và 1 tiểu đơn vị bé (30S) (còn ribosom sinh vật nhân thực có 80S gồm có 2 tiểu đơn vị là 60S và 40S). Chỉ số này có liên quan đến tỷ lệ lắng (Sevedberg).

Kháng sinh, như là erythromycin và tetracyclin, đã được phát triển để tấn công vi khuẩn như những “viên đạn ma thuật”. Chúng ưu tiên ức chế sự tổng hợp protein tại các tiểu đơn vị của ribosom vi khuẩn, trong khi lại bỏ mặc ribosom của động vật đứng một mình như thế?! Erythromycin tác dụng lên tiểu đơn vị lớn 50S, trong khi tetracyclin tác dụng lên tiểu đơn vị bé 30S

ĐẶC ĐIỂM CỦA SỰ TRAO ĐỔI CHẤT

Vi khuẩn có thể được phân chia vào các nhóm dựa trên đặc tính trao đổi chất của chúng. 2 đặc tính quan trọng bao gồm:
1) Vi sinh vật phân hóa với khí oxy
2) Vi sinh vật sử dụng nguồn năng lượng cacbon
Các đặc tính chuyển hóa khác bao gồm các sản phẩm cuối cùng của sự chuyển hóa mà do vi khuẩn tạo ra như là acid và khí

* Chlamydia và Rickettsia không có cơ quan sử dụng khí oxy để tham gia chuyển hóa chất. Chúng phải dựa vào ký sinh năng lượng, và phải “đánh cắp” ATP của vật chủ

PHÂN BỐ THEO KHÍ OXY

Khí Oxy

Việc vi khuẩn làm thế nào có thể chuyển hóa khí oxy là một trong những yếu chính tố chính dùng để phân loại chúng. Các phân tử oxy rất linh động, và khi nó được nhận thêm các điện tử (electron) thì có thể trở thành hydro peroxid (H2O2), gốc anion superoxid (O2-), và một gốc tự do hydroxyl (OH .). Tất cả những chất đó đều là chất độc đối đối với cơ thể trừ khi nó bị đã phân giải. Trong thực tế, chính các đại thực bào (macrophage) đã sản xuất ra các chất oxy hóa để dùng tiêu diệt vi khuẩn. Có 3 loại enzym do một vài vi khuẩn tạo ra để làm hỏng các chất oxy hóa đó:

1) Catalase làm ức chế tác dụng hydro peroxid theo phản ứng:

2H2O2 > 2H2O + O2

2) Peroxidase cũng có tác dụng ức chế tác dụng hydro peroxid

3) Superoxid dismutase có tác dụng ức chế tác dụng của gốc anion superoxid theo phản ứng:

O2- + O2- + 2H+ > H2O2 + O2

Vi khuẩn là một nhóm phải luôn hoạt động liên tục, với một đầu những kẻ yêu khí oxy, với tất cả sự bảo vệ hết lòng bởi các enzym, và những kẻ đó không thể nào sống được nếu thiếu vắng khí oxy. Ở phía bên đối lập là những vi khuẩn không có enzym và chúng luôn từ chối sự có mặt “ngọt ngào” của oxy:

1) Hiếu khí tuyệt đối (Obligate aerobes):

Những sinh vật này cũng giống như con người, đó là chúng chỉ dựa vào quá trình thủy phân thủy phân glycose, chu trình Kreb, và chuỗi truyền điện tử với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng. Những anh chàng này có tất cả những thứ còn trên cả enzym

2) Yếm khí tùy ý (Facultative anaerobes):

Đừng để cái tên này đánh lừa bạn ! Đó là những vi khuẩn hiếu khí. Chúng sử dụng oxi như là một chất nhận điện tử trong chuỗi truyền điện tử và có enzym catalase và superoxid dismutase. Chỉ có một điều khác biệt đó là chúng vẫn có thể phát triển khi thiếu oxy bằng cách lên men để tạo năng lượng cho hoạt động. Như vậy, chúng có điều kiện để là sinh vật kỵ khí nhưng chúng lại thích môi trường hiếu khí hơn. Điều này cũng tương tự như việc các tế bào cơ của chúng ta phải chuyển sang đường phân yếm khí (anaerobic-glycoglysis) khi phải bị hoạt động liên tục một cách quá mức.

3) Vi khuẩn vi hiếu khí (Microaerophilic)

hay còn được gọi là yếm khí chịu oxy (aerotolerant anaerobes): Đó là những vi khuẩn sử dụng sự lên men và không có hệ thống truyền điện tử (electron transport). Nó có thể chịu đựng một lượng thấp khí oxy bởi nó có superoxiddismutase (nhưng không có catalase).

4) Yếm khí bắt buộc (Obligate anaerobes):

Đó là các “chàng trai” rất ghét oxy và không hề có enzym để bảo vệ các “chàng trai” ấy. Những người làm việc trong bệnh viện, sẽ phải thường xuyên lấy máu để nuôi cấy. Họ sẽ để máu vào những lọ không có không khí để nuôi cấy, đó là phương pháp phổ biến để nuôi cấy vi khuẩn yếm khí bắt buộc.

1.10. Phổ oxy của các nhóm vi khuẩn chính

Nguồn Năng Lượng Và Cacbon

Một số sinh vật sử dụng ánh sáng như là một nguồn năng lượng (sinh vật quang tự dưỡng) và một số sinh vật lại sử dụng các hợp chất hóa học như là một nguồn năng lượng (sinh vật hóa tự dưỡng). Trong số các sinh vật sử dụng năng lượng từ hóa học, thì những sinh vật sử dụng nguồn chất vô cơ, như là amoni và sulfite thì được gọi là tự dưỡng (autotroph). Còn những sinh vật khác sử dụng nguồn cacbon hữu cơ thì được gọi là dị dưỡng (heterotroph). Tất cả vi khuẩn có vai trò quan trọng về mặt y tế là những vi khuẩn hóa dị dưỡng (chemoheterotrophs) bởi vì chúng sử dụng những hợp chất hóa học hữu cơ, như là glucose để tạo năng lượng.

Lên men (đường phân)

thì được sử dụng bởi rất nhiều vi khuẩn chuyển hóa oxy (oxygenmetabolism). Trong quá trình lên men, glucose bị chia cắt nhỏ ra thành acid pyruvic, sản sinh ATP trực tiếp. Có nhiều con đường để phân giải glucose thành pyruvate, nhưng phổ biến nhất là con đường Embden – Meyerhof. Đó là con đường đường phân mà chúng ta đã được học trong hóa sinh. Theo quá trình lên men, thì những pyruvat phải bị chia cắt ra, và các sản phẩm chuyển hóa cuối cùng trong quá trình này có thể được sử dụng để phân loại vi khuẩn. Acid lactic, ethanol, acid propionic, aid butyric, aceton, và những hỗn hợp acid khác có thể được tạo ra.

Sự hô hấp (respiration)

có thể được thực hiện ở những sinh vật hiếu khí và yếm khí tùy ý. Sự hô hấp bao gồm sự đường phân, chu trình Krebs acid-tricacboxylic và chuỗi truyền điện tử cùng với sự Phosphoryl – Oxi hóa. Đó là những con đường cùng kết hợp để sản xuất ATP.

Ký sinh nội bào bắt buộc (obligate intracellular):

Những sinh vật này không có khả năng thực hiện quá trình chuyển hóa để tổng hợp ATP và vì thế phải “đánh cắp” ATP từ vật chủ. Những sinh vật nào sống trong những tế bào của vật chủ và và không thể tồn tại nếu không có vật chủ. Ví dụ điển hình về những sinh vật ký sinh nội bào bắt buộc đó là Chlamydia và Rickettsia. Chúng buộc phải ký sinh năng lượng vì chúng cần ATP của vật chủ như là một nguồn năng lượng. Chúng tạo ra một hệ thống màng tế bào vận chuyển đặc biệt để “đánh cắp” ATP.
Sự khác biệt hơn nữa trong các quá trình chuyển hóa (như là sử dụng nguồn năng lượng từ đường, từ những sản phẩm chuyển hóa cuối cùng, và từ các nhu cầu cụ thể đối với các chất dinh dưỡng nhất định) sẽ giúp hình tượng hơn trong việc phân loại vi khuẩn và sẽ được trình bày trong các chương cụ thể về từng sinh vật.

Bài viết được dịch từ sách ” Clinical Microbiology made ridiculously simple”